ÿþVor dem Hintergrund einer früheren Studie puma basket beige [25], in der gezeigt wurde, dass ErbB4 mit Bcl-2 interagiert und dass EGFR / EGFRvIII und ErbB4 eine strukturelle Homologie aufweisen, untersuchten wir, ob EGFR / EGFRvIII mit den drei proapoptotischen Proteinen, die mit Bcl-2 koexprimieren, einen Komplex bildet Rezeptoren. Wie aus den Ergebnissen der Immunpräzipitation (IP) / Western-Blotting unter Verwendung eines EGFR-Antikörpers für IP (1c) hervorgeht, bildet EGFRvIII in GBM-Xenotransplantaten mit endogenem EGFRvIII (D-270 MG) einen Komplex mit PUMA, jedoch nicht mit Bax und Bmf und D-317 MG) und mit stabil transfiziertem EGFRvIII (U87MGEGFRvIII). In ähnlicher Weise wurde gezeigt, dass PUMA in drei EGFR-exprimierenden GBM-Zelllinien mit EGFR coimmunopräzipitiert (1d).

Um zu untersuchen, ob PUMA für die Induktion von Apoptose in GBM essentiell ist, wurde PUMA-spezifische siRNA verwendet, um die PUMA-Expression und die Reaktion von puma basket black U87MG-GBM-Zellen, die sehr niedrige EGFR-Spiegel exprimieren, auf Anisomycin, einen potenten Induktor von, herunter zu regulieren Apoptose [38] wurde untersucht. Wie in 3a gezeigt, zeigte der TUNEL-Assay, dass PUMA Knockdown U87MG-Zellen resistent gegen Apoptose (2,5%) macht, induziert durch 48-stündige Anisomycin-Behandlungen. Im Gegensatz dazu erfahren puma basket bow mit der Kontroll-siRNA transfizierte U87MG-Zellen eine signifikante Anisomycin-induzierte Apoptose (45,5%). In dem Assay repräsentieren die gelben fusionierten Signale nuklear fragmentierte DNA.

Wie erwartet zeigten unbehandelte Zellen keinen Hinweis auf Apoptose (Daten nicht gezeigt). Das Western Blot (3b) zeigte, dass die PUMA-Expression durch die PUMA-spezifische siRNA spezifisch und effizient herunterreguliert wurde. Auswirkungen der Herunterregulierung der PUMA-Expression und der erhöhten EGFRvIII-Expression auf die Induktion von Apoptose in GBM-Zellen. Das Ausmaß der Apoptose wird wie folgt berechnet: (Anzahl der apoptotischen Kerne) / (Gesamtanzahl der Kerne). In beiden Panels wurden 250-300 Zellen puma basket classic damen in jedem Experiment untersucht und drei unabhängige Experimente wurden durchgeführt, um Mittelwerte und Standardabweichungen abzuleiten. (A) PUMA-Expressions-Knockdown macht GBM-Zellen resistent gegen Apoptose, wie durch den TUNEL-Assay angezeigt.

U87MG-Vektor- und U87MG-EGFRvIII-stabile Transfektantenzellen wurden 48 Stunden lang 100 ng / ml Anisomycin ausgesetzt und dem TUNEL-Assay unterzogen, um das Ausmaß der Apoptose zu bestimmen. Die Erzeugung und Charakterisierung der isogenen Zelllinien wurde bereits beschrieben [9]. (D) Western Blot zeigt an, dass U87MG-Vektorzellen ein sehr geringes Maß an endogenem EGFR (höheres Molekulargewicht; 175 kD) exprimieren, während U87MG-EGFRvIII-Zellen eine signifikante EGFRvIII-Expression (140 kD) enthalten -Expression von EGFRvIII in U87MG-Zellen führte zu einer signifikanten Resistenz gegen Anisomycin-induzierte Apoptose (3c, d).

U87MG-EGFR- und U87MG-EGFRvIII-stabile Transfektanten und T98G-GBM-Zellen mit endogenem EGFR wurden mit 1% DMSO und 1 & mgr; M Apoptose-induzierendem Staurosporin (ST) behandelt, geerntet und einer Immunpräzipitation / Western Blot (linkes Feld) und Western Blot (rechts) unterzogen panel), wie bereits beschrieben. Es ist bekannt, dass sich PUMA auf den Mitochondrienmembranen befindet, um bei entsprechendem Stress eine Apoptose puma basket grau auszulösen [40; 41]. Begründet durch unsere Daten, die zeigen, dass EGFR und EGFRvIII PUMA gemeinsam exprimieren und interagieren und dass diese beiden Wege umgekehrt mit Apoptose verbunden sind, untersuchten wir, ob EGFR / EGFRvIII die subzelluläre PUMA-Lokalisierung regulieren könnte.

EGFR-spezifische siRNA reduzierte wirksam die EGFR-Expression, wie durch die Western-Blots gezeigt (5c-rechts). Zusätzlich zu GBM-Zellen fanden wir, dass PUMA im Zytoplasma von menschlichen MDA-MB-468-Brustkrebszellen lokalisiert ist (5d), von denen bekannt ist, dass sie signifikante Mengen von endogenem EGFR exprimieren [34]. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass PUMA im Zytoplasma von EGFR- und EGFRvIII-exprimierenden GBM- und Brustkrebszellen konstitutiv und unter apoptotischem Stress sequestriert wird.